Cas12 কার্যকলাপের টিউনেবল নিয়ন্ত্রণ সার্বজনীন এবং দ্রুত এক-পাত্র নিউক্লিক অ্যাসিড সনাক্তকরণের প্রচার করে
দ্বারা প্রকাশিত: চীনের বিজ্ঞান ও প্রযুক্তি বিশ্ববিদ্যালয়
জার্নাল: প্রকৃতি যোগাযোগ
প্রভাব ফ্যাক্টর: 14.7
MIRA প্রযুক্তি ব্যবহার করে, সোডিয়াম হেপারিনের উপর ভিত্তি করে একটি সর্বজনীন এক-পট ফ্লুরোসেন্ট নিউক্লিক অ্যাসিড সনাক্তকরণ পদ্ধতি (সারভে) তৈরি করা হয়েছিল৷ গবেষণায় দেখা গেছে যে সোডিয়াম হেপারিন Cas12a-crRNA বাঁধাই প্রক্রিয়ায় হস্তক্ষেপ করে Cas12a ক্লিভেজ কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। সোডিয়াম হেপারিন ঘনত্ব সামঞ্জস্য করে, সার্ভে ক্লাসিক এবং সাবঅপ্টিমাল PAM সিকোয়েন্সের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং একাধিক Cas12 সাব-টাইপের ক্ষেত্রে প্রযোজ্য। মাত্র 15-20 মিনিটের শনাক্তকরণের সময় সহ এই পদ্ধতিটি মাঙ্কিপক্স সিউডোভাইরাস, ইনফ্লুয়েঞ্জা A ভাইরাস এবং SARS-CoV-২ শনাক্ত করার জন্য 95%-এর বেশি সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা অর্জন করে। এটি কম খরচে-এবং চিকিৎসা ক্ষেত্রের রোগ নির্ণয় এবং পরিবেশগত নিরীক্ষণের জন্য একটি নতুন, পয়েন্ট-অফ-কেয়ার সনাক্তকরণ পদ্ধতি প্রদান করে, যা ঐতিহ্যগত CRISPR ডায়াগনস্টিকসে সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতার মধ্যে কঠিন ভারসাম্য রক্ষা করে।
1. হেপারিন সোডিয়ামের ক্রিয়া পদ্ধতির উপর অধ্যয়ন করুন
Cas12a-crRNA সিস্টেমে 10nM টার্গেট ডিএনএ ধারণ করে একটি ফ্লুরোসেন্ট প্রোব যোগ করা হয়েছিল, এবং সোডিয়াম হেপারিন যোগ না করে একটি দ্রুত এবং উল্লেখযোগ্য ফ্লুরোসেন্ট সংকেত পরিলক্ষিত হয়েছিল। যখন 0.2ug/ml সোডিয়াম হেপারিন যোগ করা হয়েছিল, তখন ফ্লুরোসেন্ট সংকেত নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর অনুরূপ ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে সোডিয়াম হেপারিন ট্রান্স-Cas12a-এর ক্লিভেজ কার্যকলাপকে ব্যাপকভাবে বাধা দেয় সোডিয়াম হেপারিন-এর ঘনত্ব 0.2ug/mL থেকে 0.5ug/mL-এ বৃদ্ধি পাওয়ায়, Cas12a-এর cis-ক্লিভেজ কার্যকলাপ ধীরে ধীরে বাধাগ্রস্ত হয়, এবং 0.5ug/mL-এ, ট্রান্স-ক্লিভেজ কার্যকলাপ প্রায় সম্পূর্ণরূপে বাধাগ্রস্ত হয়৷ সোডিয়াম হেপারিনের ক্রিয়া পদ্ধতির উপর গবেষণায় দেখা গেছে যে সোডিয়াম হেপারিনের নেতিবাচক চার্জযুক্ত গ্রুপগুলি Cas12a-এর সাথে crRNA এর সঠিক আবদ্ধতায় হস্তক্ষেপ করে এবং crRNACas12a বাইনারি কমপ্লেক্স গঠনকে প্রভাবিত করতে পারে।
- MIRA-Cas12a one-পট সনাক্তকরণ
সোডিয়াম হেপারিন-এর কার্যপ্রণালী যাচাই করার পর, কাগজটি একটি এক-পাত্র সনাক্তকরণ কৌশল (MIRA-Cas12a), MIRA পরিবর্ধন এবং Cas12a-মিডিয়াটেড ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণকে একত্রিত করে একটি একক টিউবে অনুসন্ধান করেছে।
সোডিয়াম হেপারিনের অনুপস্থিতিতে, MIRA-Cas12a সংমিশ্রণ 0.1aM থেকে 10fM এর লক্ষ্য জিনের ঘনত্বের মধ্যে কোন উল্লেখযোগ্য প্রতিপ্রভ সংকেত তৈরি করেনি। সোডিয়াম হেপারিনের 40µg/mL এ, 1aM (≈0.6 copies/μL, ভলিউম=30μL) থেকে 10fM (≈6,000 copies/μL, ভলিউম=30, 00dμL-এ উন্নতি করা) লক্ষ্য ঘনত্বের পরিসীমা জুড়ে একটি উল্লেখযোগ্য প্রতিপ্রভ সংকেত পরিলক্ষিত হয়েছে। সোডিয়াম হেপারিন ছাড়া একটি সিস্টেমের তুলনায় সনাক্তকরণ সংবেদনশীলতা।
মাঙ্কিপক্স ভাইরাস টেমপ্লেটের ঘনত্ব ছিল 10 fM, এবং Cas12a-crRNA (100 nM) টার্গেট জিন f31 এবং b6r সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়াটি 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 এবং 20 মিনিটে সমাপ্ত করা হয়েছিল এবং বিভিন্ন সময়ে MIRA পরিবর্ধন পণ্য সামগ্রী অ্যাগারোজ জেলগুলিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ পণ্যগুলি তিনটি ভিন্ন সেটিংসের অধীনে অ্যাগারোজ জেলে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল: MIRA-Cas12a ছাড়া হেপারিন সোডিয়াম, MIRA-Cas12a হেপারিন সোডিয়াম ছাড়া, এবং MIRA-Cas12a হেপারিন সোডিয়াম ছাড়া৷ ফলাফলগুলি দেখায় যে হেপারিন সোডিয়ামের অনুপস্থিতিতে, Cas12a এর উচ্চ cis-ক্লিভেজ কার্যকলাপের কারণে নিউক্লিক অ্যাসিড পরিবর্ধন বাধাগ্রস্ত হয়েছিল। যাইহোক, Cas12a এর cis-ক্লিভেজ কার্যকলাপ হ্রাসের কারণে হেপারিন সোডিয়াম যোগ করায় উল্লেখযোগ্যভাবে নিউক্লিক অ্যাসিড পরিবর্ধন বৃদ্ধি পায়।
নিবন্ধটি দেখায় যে সোডিয়াম হেপারিনের উপর ভিত্তি করে একটি সর্বজনীন এক-পট ফ্লুরোসেন্ট নিউক্লিক অ্যাসিড সনাক্তকরণ পদ্ধতি (সারভে) ক্লাসিক PAM এবং সাবঅপ্টিমাল PAM ক্রম উভয়ই ব্যবহার করে অর্জন করা যেতে পারে। এছাড়াও, LbCas12a, AsCas12a এবং AapCas12b ছাড়াও CRISPR-Dx পদ্ধতিতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। MIRA-AsCas12a ব্যবহার করে সিস্টেমে, ফ্লুরোসেন্স শুধুমাত্র 40ug/mL সোডিয়াম হেপারিন-এর উপস্থিতিতে পরিলক্ষিত হয়, যা নির্দেশ করে যে এটি f31 এবং b6r জিনের 1fM সনাক্ত করতে পারে। সোডিয়াম হেপারিনের অনুপস্থিতিতে, MIRA-AapCas12b 1 f31 এবং b6r জিন সনাক্ত করতে পারে। 20ug/mL সোডিয়াম হেপারিনের প্রয়োগ শুধুমাত্র MIRA-AapCas12b সনাক্তকরণের হারকে ত্বরান্বিত করেনি, বরং ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতাও বাড়িয়েছে। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে সোডিয়াম হেপারিন ডোজ ব্যবহার করে বিকশিত এক-পাত্র পদ্ধতি অন্যান্য Cas12 সাব-টাইপের ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য।
