C সিআরআইএসপিআর সিএএস 13 এ সিস্টেম এক্সপ্রেসের ভিত্তিতে একটি মাইক্রোপটারাস সালময়েডস র্যাবডোভাইরাস সনাক্তকরণ পদ্ধতি প্রতিষ্ঠা
ঝাং মিনলিন, হুয়াং ফেংকিউই, জুও জিয়াওলিং, লিয়াং জিয়ানোও, লিয়াং কাইশান, ড্যান জিনহং, লি জোঙ্গিয়াং, ইউ জি, লুও লিয়ুয়ান, জিজি, জিজি, ঝাও হুইহং, ওয়াং জংয়ের জন্য একটি ডিটেকশন পদ্ধতির জন্য একটি ডিটেকশন পদ্ধতিতে। হাইড্রোবায়োলজির চাইনিজ জার্নাল, 2024, 48 (2): 283-291} Doi: 10.7541/2023.2023.0199
মাইক্রোপটারাস সালময়েডস, যা ক্যালিফোর্নিয়া বাস বা আমেরিকান ব্ল্যাক বাস নামেও পরিচিত, এটি উত্তর আমেরিকার একটি মিঠা পানির মাছ। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, এটি উচ্চ বাজারের চাহিদার কারণে এটি বিশ্বব্যাপী একটি গুরুত্বপূর্ণ খামারযুক্ত মাছ হয়ে উঠেছে: মাইক্রোপটারাস সালময়েডগুলিতে দৃ firm ় মাংস, কয়েকটি হাড়, সুস্বাদু স্বাদ, সমৃদ্ধ পুষ্টি, বিশেষত উচ্চ প্রোটিন এবং কম ফ্যাট রয়েছে, যা গ্রাহকদের স্বাস্থ্যকর খাবারের চাহিদা পূরণ করে। অতএব, বাজার মূল্য তুলনামূলকভাবে বেশি এবং এটি প্রায়শই উচ্চ-প্রান্তের ক্যাটারিং বাজারে ব্যবহৃত হয়। দ্রুত বৃদ্ধি: মাইক্রোপটারাস সালময়েডগুলি দ্রুত বৃদ্ধি পায় এবং সাধারণত 6-8 মাসে পণ্য স্পেসিফিকেশনগুলিতে পৌঁছতে পারে। এটি শর্ট-সাইকেল প্রজননের জন্য উপযুক্ত এবং দ্রুত বিনিয়োগের রিটার্নগুলি উপলব্ধি করতে পারে। শক্তিশালী রোগ প্রতিরোধের: অন্যান্য খামারযুক্ত মাছের সাথে তুলনা করে মাইক্রোপটারাস সালময়েডগুলির পরিবেশের সাথে শক্তিশালী অভিযোজনযোগ্যতা রয়েছে, কম বড় আকারের রোগের প্রাদুর্ভাব রয়েছে এবং প্রজনন ঝুঁকি হ্রাস করে। বাস্তুসংস্থান প্রজনন: লার্জমাউথ বাস অন্যান্য মিঠা পানির মাছ যেমন সিলভার কার্প এবং গ্রাস কার্পের সাথে মিশ্রিত করা যেতে পারে, যা পুকুরের পরিবেশগত ভারসাম্য অর্জন করতে এবং সম্পদের ব্যবহারকে সর্বাধিকতর করতে, প্রজনন দক্ষতা এবং অন্যান্য কারণগুলিকে আরও উন্নত করতে সহায়তা করে। এটি ডিনার এবং জলজ কৃষকরা স্বাগত জানায় এবং সাম্প্রতিক বছরগুলিতে এর প্রজনন স্কেল দ্রুত বৃদ্ধি পেয়েছে।
যদিও মাইক্রোপটারাস সালময়েডগুলি তুলনামূলকভাবে রোগ-প্রতিরোধী, তবুও তারা প্রজনন অবস্থার অধীনে কিছু রোগে ভুগতে পারে। এর মধ্যে মাইক্রোপটারাস সালময়েডস র্যাবডোভাইরাস (এমএসআরভি) অত্যন্ত ক্ষতিকারক: এটি ১৯৯১ সালে মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের ফ্লোরিডায় প্রথম আবিষ্কার করা হয়েছিল The ভাইরাসটি প্রাথমিকভাবে বন্য লার্জমাউথ বাস জনসংখ্যায় সনাক্ত করা হয়েছিল এবং তারপরে ধীরে ধীরে মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রে অনেকগুলি মিঠা পানির হ্রদ এবং জলাধারগুলিতে ছড়িয়ে পড়েছিল, লার্গমাউথের একটি প্রধান পথের একটি হয়ে ওঠে।
রোগাক্রান্ত মাছের ক্লিনিকাল লক্ষণ
উত্তর: স্বাস্থ্যকর লার্জমাউথ বাস, তীরটি কুসুম থলিটি নির্দেশ করে; বি: অসুস্থ লার্জমাউথ বাস, তীরটি কুসুমের থলিটি নির্দেশ করে।
সংক্রমণের উত্স প্রায়শই সংক্রামিত ভাজা বা প্রাপ্তবয়স্ক মাছ, দূষিত জলাশয় এবং ভাইরাস বহনকারী বন্য মাছ; এই ভাইরাসটি সরাসরি যোগাযোগ, মলদ্বার মলত্যাগ এবং জলাশয়ের মাধ্যমে সংক্রমণিত হতে পারে এবং এটি জলের গুণমান বা উচ্চ ঘনত্বের প্রজনন অবস্থার অধীনে ঘটে। বিচ্ছুরণ। ভাইরাসটি কিশোর মাছগুলিতে অলসতা, ঘোরাঘুরি, পেটের ফোলা এবং শরীরের বিকৃতি ঘটাতে পারে, পাশাপাশি নেক্রোটিক আলসার এবং মাল্টি-অর্গের রক্তপাতকে প্ররোচিত করতে পারে। একবার সংক্রামিত হয়ে গেলে মৃত্যুর হার 90%ছাড়িয়ে যায়।
কৃত্রিমভাবে সংক্রামিত মাইক্রোপটারাস সালময়েডগুলির ক্লিনিকাল লক্ষণগুলি
উত্তর: স্বাস্থ্যকর লার্জমাউথ বাস; বি, সি, ডি: কৃত্রিমভাবে সংক্রামিত লার্জমাউথ বাস।
প্রতি বছর, মাইক্রোপটারাস সালময়েডস ফ্রাইয়ের 30% এরও বেশি এমএসআরভির কারণে হারিয়ে যায়। বর্তমানে, ভাইরাসের জন্য চিকিত্সা এবং সনাক্তকরণের পদ্ধতিগুলি এখনও অপরিণত, এবং এটির চিকিত্সার জন্য কোনও নির্দিষ্ট ওষুধ নেই। অতএব, সংক্রমণের আগে সময়মতো ভাইরাস সনাক্ত করা এবং কার্যকর প্রতিরোধমূলক ব্যবস্থা গ্রহণ করা খুব প্রয়োজনীয়, যা প্রজনন প্রক্রিয়াতে ক্ষয়কে একটি নির্দিষ্ট পরিমাণে হ্রাস করতে পারে;
তদতিরিক্ত, বিদ্যমান সনাক্তকরণ প্রযুক্তির সাথে জটিল সনাক্তকরণ সরঞ্জাম ছাড়াই সাইট সনাক্তকরণ করা কঠিন। এই চ্যালেঞ্জের মুখে, দক্ষিণ চীন কৃষি বিশ্ববিদ্যালয়ের গবেষণা দলটি সিআরআইএসপিআর-সিস্টেমের সাথে এমআইআরএর সংমিশ্রণে একটি নতুন সনাক্তকরণ পদ্ধতি তৈরি করেছে। এই পদ্ধতির দৃ strong ় সুনির্দিষ্টতা, উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং সহজ অপারেশন রয়েছে, যা এমএসআরভি সনাক্তকরণের দক্ষতা ব্যাপকভাবে উন্নত করে এবং এমএসআরভি যত তাড়াতাড়ি সম্ভব সনাক্ত করতে এবং প্রতিরোধ এবং নিয়ন্ত্রণ ব্যবস্থা গ্রহণ করতে সহায়তা করে।
মীরা প্রাইমার সংমিশ্রণ স্ক্রিনিং
লক্ষ্য ক্রমযুক্ত জিন খণ্ডকে প্রশস্ত করতে বিভিন্ন এমআরএ প্রাইমারের দুটি জোড়া ব্যবহার করা হয়েছিল এবং প্রশস্ত পণ্যগুলি আগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিসের শিকার হয়েছিল। ইলেক্ট্রোফোরসিস গ্রাফটি 100 বিপি-র অবস্থানে অবস্থিত ছিল এবং উজ্জ্বল ব্যান্ডগুলি তিনটি লেনে উপস্থিত হয়েছিল, যা ইঙ্গিত করে যে সেখানে অ-নির্দিষ্ট প্রশস্তকরণ পণ্য ছিল। লেন 2 এবং 3 এ 250 বিপি -তে পরিবর্ধিত টার্গেট ব্যান্ডগুলি যথাক্রমে চিত্র জে সফ্টওয়্যার দ্বারা পরিমাণগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং পরিমাণগত বিশ্লেষণের ফলাফলগুলি "ধূসর মান" দ্বারা প্রকাশ করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের ফলাফলগুলি থেকে, এটি উপসংহারে পৌঁছানো যায় যে ধূসর মান যত কম হবে, প্রাইমার ব্যবহারের হার তত বেশি, অর্থাৎ প্রাইমার নির্দিষ্ট বাইন্ডিং প্রশস্তকরণ দক্ষতা তত বেশি।
ফলাফলগুলি দেখিয়েছিল যে এমআইআরএ-এফ 2/আর 2 প্রাইমার জুটি ব্যবহার করা হলে নির্দিষ্ট বাইন্ডিং পরিবর্ধনের দক্ষতা বেশি ছিল।
মীরা প্রাইমার জুটি স্ক্রিনিং ইলেক্ট্রোফোরসিস জেল চিত্র এবং ধূসর মান বিশ্লেষণ
ক। ইলেক্ট্রোফোরসিস লেন এম: 2000 বিপি ডিএনএ চিহ্নিতকারী; ইলেক্ট্রোফোরেসিস লেন 1। নেতিবাচক ডিএনএ নমুনা পরিবর্ধন; ইলেক্ট্রোফোরেসিস লেন 2। মিরা-এফ 1/আর 1 প্রাইমার জুটি লক্ষ্য খণ্ডকে প্রশস্ত করে (বাক্সে প্রদর্শিত 224 বিপি); খ। ব্যান্ড ধূসর মান বিশ্লেষণ (বাক্সে প্রদর্শিত হিসাবে)
সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ সনাক্তকরণ সিস্টেম
সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ সনাক্তকরণ সিস্টেমের প্রতিক্রিয়া শেষ হওয়ার পরে, ফলাফলগুলি পর্যবেক্ষণ করার জন্য এটি অতিবেগুনী আলো দিয়ে বিকিরণ করা হয়।
সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ সনাক্তকরণ সিস্টেম-ফ্লুরোসেন্স ব্রাইটনেস ডায়াগ্রাম
1-3} আরএনএ স্ট্যান্ডার্ড সহ পুরো সিস্টেমটি যুক্ত হয়েছে; 4। কোনও সিআরআরএনএ যুক্ত করা হয়নি; 5 ... কোনও সিএএস 13 এ প্রোটিন যুক্ত করা হয়নি; 6। কোনও এসএসআরএনএ রিপোর্টার প্রোব যুক্ত করা হয়নি; 7। নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ
সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি অনুকূল প্রতিক্রিয়া সিস্টেম
আমরা আরএনএ স্ট্যান্ডার্ড এবং প্রশস্ত নমুনা আরএনএ ব্যবহার করে পরীক্ষা -নিরীক্ষা করেছি। লক্ষ্য আরএনএর অবস্থানের গতি সিআরআরএনএ 1 এর চেয়ে সিআরআরএনএ 2 এর সাথে আরও ভাল ছিল। সিআরআরএনএ 1 এর সিআরআরএনএ 2 এর চেয়ে শক্তিশালী চূড়ান্ত ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল ছিল। সমান অনুপাতে সিআরআরএনএ 1+ সিআরআরএনএ 2 এর মিশ্র ব্যবহার উভয়ের সুবিধাগুলি একত্রিত করতে পারে এবং আরও ভাল প্রতিক্রিয়া দক্ষতা অর্জন করতে পারে।
সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ প্রতিক্রিয়া শর্ত এবং সনাক্তকরণের ফলাফলগুলি অনুকূলিত করা
ক। বিভিন্ন স্পেসার সিকোয়েন্সগুলির সাথে সিআরআরএনএ ব্যবহার করে স্ট্যান্ডার্ড আরএনএর সনাক্তকরণের ফলাফলের তুলনা;
খ। বিভিন্ন তাপমাত্রায় সনাক্তকরণ সিস্টেম দ্বারা সনাক্ত করা স্ট্যান্ডার্ড আরএনএর ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল ডেটার তুলনা;
গ। বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে আরএনএ রিপোর্টার প্রোব ব্যবহার করে সনাক্ত করা স্ট্যান্ডার্ড আরএনএর ফ্লুরোসেন্স সিগন্যাল ডেটার তুলনা;
ডি। বিভিন্ন ঘনত্বের অনুপাতের সাথে সিএএস 13 এ/সিআরআরএনএ প্রোব কমপ্লেক্সগুলি ব্যবহার করে সনাক্ত করা স্ট্যান্ডার্ড আরএনএ সনাক্তকরণের ফলাফলগুলির তুলনা;
সনাক্তকরণ সিস্টেমে প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রার প্রভাব অনুসন্ধান করতে, 31 ডিগ্রি, 34 ডিগ্রি, 37 ডিগ্রি এবং 41 ডিগ্রির বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা সেট করা হয়েছিল। সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেমের সর্বোত্তম প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা 37 ডিগ্রি ছিল।
পরীক্ষার পরিসরের মধ্যে সনাক্তকরণ সিস্টেমে এসএসআরএনএ রিপোর্টার প্রোব ঘনত্বের প্রভাব অনুসন্ধান করতে, ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতাটি এসএসআরএনএ রিপোর্টার প্রোব ঘনত্বের সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল। এসএসআরএনএ রিপোর্টার প্রোবের ঘনত্বের সনাক্তকরণ প্রভাব 500-700 এনএমএল/এল এ খুব বেশি আলাদা ছিল না। প্রকৃত অর্থনৈতিক সমস্যাগুলি বিবেচনা করে, সর্বোত্তম এসএসআরএনএ রিপোর্টার প্রোবের ঘনত্ব 500 এনএমএল/এল ছিল।
সনাক্তকরণ সিস্টেমে বিভিন্ন সিএএস 13 এ এবং সিআরআরএনএ প্রতিক্রিয়া ঘনত্বের অনুপাতের প্রভাব অনুসন্ধান করতে, যখন সিএএস 13 এ: সিআরআরএনএর অনুপাত 4: 1 এবং 3: 1 ছিল প্রতি অংশে 100 এনএমএল/এল অনুপাতের ভিত্তিতে, সিএএস 13 এ স্যাচুরেশনে পৌঁছেছিল; যখন CAS13A এর পরিমাণ স্থির ছিল, তখন ফ্লুরোসেন্স সিগন্যালের তীব্রতা সিআরআরএনএর পরিমাণ বৃদ্ধির সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল না। অতএব, যখন সিআরআরএনএর সাথে সিএএস 13 এ অনুপাত 2: 1 হয়, সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেম সর্বাধিক সনাক্তকরণ ক্রিয়াকলাপ অর্জন করতে পারে।
সংবেদনশীলতা মূল্যায়ন
সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেম দ্বারা এমএসআরভির ন্যূনতম সনাক্তকরণের ঘনত্বটি অন্বেষণ করার জন্য, আরএনএ স্ট্যান্ডার্ডটি একটি সিরিজে 10 বার মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেম দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেমটি এমএসআরভি টার্গেট আরএনএর কমপক্ষে 100FM সনাক্ত করতে পারে। যখন লক্ষ্য আরএনএ ঘনত্ব 100FM এর চেয়ে কম হয়, তখন মেশিন দ্বারা সনাক্ত করা ফ্লুরোসেন্স সিগন্যালটি ফাঁকা নিয়ন্ত্রণের চেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা হয় না। অতএব, সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেম কমপক্ষে 100fm এমএসআরভি এসএসআরএনএ সনাক্ত করতে পারে।
এমএসআরভির জন্য সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেমের নির্দিষ্টতার মূল্যায়ন
নমুনা পরীক্ষা
সমুদ্র খাদ খামার থেকে সংগ্রহ করা অসুস্থতার সুস্পষ্ট লক্ষণ সহ অসুস্থ মাছের নমুনাগুলির জন্য, আমরা যাচাই করেছি যে অসুস্থ মাছের দ্বারা সংক্রামিত প্যাথোজেন এমএসআরভি ছিল কিনা। আমরা পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য এমএসআরভি ক্যাপসিড প্রোটিন সিকোয়েন্সের জন্য নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করেছি এবং পরীক্ষার জন্য ইলেক্ট্রোফোরেসিস ডায়াগ্রামে সংশ্লিষ্ট ব্যান্ডগুলি প্রেরণ করেছি। তুলনার পরে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে এটি এমএসআরভি ছিল।
এমএসআরভি সিকোয়েন্স তথ্যের নিশ্চিতকরণ
ক। এমএসআরভি প্রাইমারের 228 বিপি পণ্য ব্যান্ডের পিসিআর পরিবর্ধন; খ। এমএসআরভি ক্যাপসিড প্রোটিন সিকোয়েন্স এনসিবিআইয়ের সাথে তুলনা করে, বোল্ড সিকোয়েন্সগুলি প্রবাহ এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমার বাইন্ডিং সাইটগুলি এবং ছায়াযুক্ত অঞ্চলগুলি সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সিআরআরএনএ 1 বাইন্ডিংয়ের জন্য লক্ষ্য অবস্থানগুলি
এমএসআরভিতে সংক্রামিত রোগাক্রান্ত মাছের নমুনাগুলি ভাইরাল আরএনএর জন্য প্রিট্রেটেড এবং পূর্বনির্ধারিত ছিল এবং তারপরে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের সাথে পরীক্ষা করা হয়েছিল। একই সময়ে, প্রচলিত কিউপিসিআর এর সাথে তুলনা করার জন্য নমুনাগুলির সিডিএনএ বের করা হয়েছিল। সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেম দ্বারা সনাক্ত করা ইতিবাচক নমুনাগুলি (নং 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 এবং 15) প্রচলিত কিউপিসিআর এর ফলাফলের সমান ছিল, যেখানে কিউপিসিআর এর সিকিউ মান 18 এবং 25 এর মধ্যে ছিল; যদিও নেতিবাচক নমুনার প্রান্তিক চক্র সংখ্যা (নং 1, 2, 4, 5, 9, 10 এবং 11) 38 এর চেয়ে বেশি ছিল, এটি ইঙ্গিত করে যে নমুনাগুলি এমএসভিআর ভাইরাস বহন করে না। সংক্ষেপে, সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেম এবং প্রচলিত আরটি-কিউপিসিআর সনাক্তকরণ ডেটা সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল, এটি ইঙ্গিত করে যে সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ সিস্টেমটি সম্ভাব্য এবং এটি একটি নির্দিষ্ট পরিমাণে মূল প্রচলিত এবং জটিল সনাক্তকরণের পদ্ধতিগুলি প্রতিস্থাপন করতে পারে।
কিউপিসিআর এবং সিআরআইএসপিআর সহ নমুনা কিউপিসিআর সনাক্তকরণ ডেটার উল্লম্ব তুলনা চার্ট
ক। এমএসআরভি ক্লিনিকাল নমুনা থ্রেশহোল্ড চক্র নম্বর ডায়াগ্রামের কিউপিসিআর সনাক্তকরণ; সনাক্ত করা নমুনা চক্র নম্বরটি টি-টেস্ট বিশ্লেষণ (** পি ব্যবহার করে নেতিবাচক রেফারেন্স চক্র সংখ্যার সাথে তুলনা করা হয়েছিল<0.01);
খ। এমএসআরভি ক্লিনিকাল নমুনা ফ্লুরোসেন্স ডায়াগ্রামের এমআইআরএ সনাক্তকরণের সাথে মিলিত সিএএস 13 এ; সনাক্ত করা নমুনা ফ্লুরোসেন্স মানটি টি-টেস্ট বিশ্লেষণ (** পি ব্যবহার করে নেতিবাচক রেফারেন্স ফ্লুরোসেন্স মানের সাথে তুলনা করা হয়েছিল<0.01)
সংক্ষেপে, এই গবেষণায় প্রতিষ্ঠিত সিআরআইএসপিআর/সিএএস 13 এ-এমএসআরভি সনাক্তকরণ পদ্ধতির জন্য ব্যয়বহুল পরীক্ষামূলক যন্ত্রগুলির প্রয়োজন হয় না, সাইটে সনাক্তকরণ দ্রুত, নির্ভুল এবং সুবিধাজনক করে তোলে। অতএব, যদি এই সনাক্তকরণ পদ্ধতিটি সময়মতো প্রকৃত প্রজনন প্রক্রিয়াতে এমএসআরভি আবিষ্কার করতে এবং লক্ষ্যযুক্ত এবং কার্যকর ব্যবস্থা গ্রহণের জন্য ব্যবহৃত হয়, তবে এটি প্রজনন প্রক্রিয়াতে রোগের ফলে সৃষ্ট ক্ষতির পরিমাণ হ্রাস করতে পারে। তদতিরিক্ত, এই সনাক্তকরণ পদ্ধতিটি দ্রুত, অত্যন্ত সংবেদনশীল এবং নির্দিষ্ট এবং দুর্দান্ত অ্যাপ্লিকেশন এবং প্রচারের সম্ভাবনা রয়েছে।