ঘাস চিংড়ি চীনের মিঠা পানির জলজ শিল্পের একটি গুরুত্বপূর্ণ অর্থনৈতিক প্রজাতি। তবে সাম্প্রতিক বছরগুলিতে,হেপাটোপ্যানক্রিয়াটিক মাইক্রোস্পরিডিয়াম(ইএইচপি), চিংড়িটির হেপাটোপানক্রিয়াস সংক্রামিত একটি পরজীবী, শিল্পকে মারাত্মকভাবে প্রভাবিত করেছে। যেহেতু বর্তমানে এই রোগের চিকিত্সার জন্য কোনও কার্যকর ওষুধ বা ভ্যাকসিন নেই, তাই এর বিস্তার রোধে দ্রুত এবং সঠিক সনাক্তকরণ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
A.magnified 9। 0 × 1 0 3 বার; বি। ম্যাগনিফাইড 5.0 × 104 বার।
কিয়াও ইআই, শেন হুই, ওয়ান শিহে, ফ্যান জিয়ানপিং, জিয়াং জিই, লি হুই, ওয়াং লিবাও, শি ওয়েঞ্জুন, চেং জি। লিটোপেনিয়াস ভ্যানামেইতে হেপাটোপ্যানক্রিয়াটিক মাইক্রোস্পরিডিয়ামের বিচ্ছিন্নতা এবং রূপচর্চা পর্যবেক্ষণ। চীনের ফিশারি সায়েন্সেস জার্নাল, 2018, 25 (5): 1051-1058} Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430।
ইএইচপি সনাক্তকরণ প্রাথমিকভাবে আণবিক জীববিজ্ঞান পদ্ধতির উপর নির্ভর করে, পিসিআর প্রযুক্তি সর্বাধিক সাধারণ। যাইহোক, পিসিআর উচ্চ সংবেদনশীলতা সরবরাহ করার সময়, এটির জন্য ব্যয়বহুল পিসিআর সরঞ্জাম এবং একটি বিশেষ পরীক্ষাগার পরিবেশ প্রয়োজন, এটি ক্ষেত্রের ব্যবহারের জন্য এটি অনুপযুক্ত করে তোলে। এই সমস্যাটির সমাধানের জন্য, গবেষণা দলটি এমআইআরএ প্রযুক্তির উপর ভিত্তি করে দুটি দ্রুত সনাক্তকরণ পদ্ধতি তৈরি করেছে। এই পদ্ধতিগুলি উচ্চ সংবেদনশীলতা, দ্রুত প্রতিক্রিয়া এবং সহজ অপারেশন সরবরাহ করে, জটিল পরীক্ষাগার সরঞ্জামের প্রয়োজন ছাড়াই চিংড়িটিতে ইএইচপির দক্ষ এবং দ্রুত সনাক্তকরণ সক্ষম করে, এইভাবে বর্তমান সনাক্তকরণ পদ্ধতির ফাঁক পূরণ করে।
গবেষণায় ব্যবহৃত প্রশস্তকরণ রিএজেন্টস:
- ডিএনএ আইসোথার্মাল র্যাপিড এমপ্লিফিকেশন কিট (বেসিক)
- ডিএনএ আইসোথার্মাল র্যাপিড এমপ্লিফিকেশন কিট (কলয়েডাল সোনার স্ট্রিপ টাইপ)
এমআইআরএ প্রযুক্তি হ'ল একটি মাল্টি-এনজাইম আইসোথার্মাল র্যাপিড নিউক্লিক অ্যাসিড পরিবর্ধন পদ্ধতি। এর মূল নীতিটি দ্রুত নিউক্লিক অ্যাসিড পরিবর্ধন অর্জনের জন্য পরিবেষ্টিত তাপমাত্রায় একাধিক কার্যকরী প্রোটিনের সমন্বিত ক্রিয়া জড়িত, সত্যিকারের পোর্টেবল, সাইটে নিউক্লিক অ্যাসিড সনাক্তকরণ সক্ষম করে।
গবেষণা পদ্ধতি
নমুনা নিষ্কাশন
গবেষণা দলটি লিয়াওনিং প্রদেশের তিনটি চিংড়ি খামার থেকে সংক্রামিত এবং স্বাস্থ্যকর ঘাসের চিংড়ি উভয় নমুনা সংগ্রহ করেছে, চিংড়িটির হেপাটোপানক্রিয়াস থেকে ডিএনএ উত্তোলন করেছে।
প্রাইমার ডিজাইন
এমআইআরএ প্রাইমারের তিনটি সেট ইএইচপি -র এস 8 সেরিন প্রোটিন জিনকে লক্ষ্য করে ডিজাইন করা হয়েছিল (জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেসেশন নম্বর: 182063 এ)। এই জিনটির সনাক্তকরণের নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করে অনন্য সক্রিয় সাইট রয়েছে।
মীরা-এজ এবং মীরা-এলএফডি সনাক্তকরণ
(ক) অনুকূলিত আরপিএ-বয়সের প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা। এম: ডিএল 500 চিহ্নিতকারী; এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; স্ট্রেনগুলি 1-5: 25 ডিগ্রি, 30 ডিগ্রি, 37 ডিগ্রি, 39 ডিগ্রি এবং 42 ডিগ্রি।
(খ) আরপিএ-বয়সের প্রতিক্রিয়া সময়কে অনুকূলিত করা হয়েছে। এম: ডিএল 500 চিহ্নিতকারী; এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; 1: 10 মিনিট; 2: 20 মিনিট; 3: 30 মিনিট; 4: 40 মিনিট।
(গ) অপ্টিমাইজড আরপিএ-এলএফডি প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা। এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; 1: 25 ডিগ্রি; 2: 30 ডিগ্রি; 3: 37 ডিগ্রি; 4: 39 ডিগ্রি; 5: 42 ডিগ্রি।
(D) আরপিএ-এলএফডি প্রতিক্রিয়া সময় অনুকূলিত করা। এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; 1: 5 মিনিট; 2: 10 মিনিট; 3: 20 মিনিট।
দুটি এমআইআরএ সনাক্তকরণ পদ্ধতি, মীরা-এজ (আগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস) এবং মিরা-এলএফডি (কলয়েডাল সোনার পার্শ্বীয় প্রবাহ ইমিউনোসায়), ইএইচপি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। গবেষণা দল পরীক্ষার মাধ্যমে প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা এবং সময়কে অনুকূল করে তোলে। মিরা-এজ 37 ডিগ্রি এ 30 মিনিটের মধ্যে লক্ষ্য ডিএনএকে প্রশস্ত করেছে, যখন এমআইআরএ-এলএফডি মাত্র 10 মিনিটের মধ্যে 37 ডিগ্রিতে পরিবর্ধন সম্পন্ন করেছে, ফলাফলগুলি 5 মিনিটের মধ্যে পঠনযোগ্য।
পরীক্ষামূলক ফলাফল
নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতা
(ক) আরপিএ-এজ সনাক্তকরণের নির্দিষ্টতা। এম: ডিএল 1000 চিহ্নিতকারী; পি: নোসেমা বোম্বাইসিস; 1: EHP; 2: এনসেফালিটোজুন; 3: মাইক্রোস্পরিডিয়া; 4: হোয়াইট স্পট সিন্ড্রোম ভাইরাস; 6: অস্বাভাবিক; এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ।
(খ) আরপিএ-এলএফডি সনাক্তকরণের নির্দিষ্টতা। পি: নোসেমা বোম্বাইসিস; এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; 1: EHP; 2: এনসেফালিটোজুন; 3: মাইক্রোস্পরিডিয়া; 4: হোয়াইট স্পট সিন্ড্রোম ভাইরাস; 6: অস্বাভাবিক।
(গ) রিকম্বিন্যান্ট প্লাজমিডগুলির গ্রেডিয়েন্ট ডিলিউশন সহ আরপিএ-বয়সের সংবেদনশীলতা। এম: ডিএল 500 চিহ্নিতকারী; এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; 1: 4.7 × 10^5 অনুলিপি/µL; 2: 4.7 × 10^4 অনুলিপি/µL; 3: 4.7 × 10^3 অনুলিপি/µL; 4: 4.7 × 10^2 অনুলিপি/µL; 5: 4.7 অনুলিপি/µl; 6: 4.7 অনুলিপি/µl।
(ঘ) রিকম্বিন্যান্ট প্লাজমিডগুলির গ্রেডিয়েন্ট ডিলিউশন সহ আরপিএ-এলএফডি এর সংবেদনশীলতা। এন: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; 1: 4.7 × 10^5 অনুলিপি/µL; 2: 4.7 × 10^4 অনুলিপি/µL; 3: 4.7 × 10^3 অনুলিপি/µL; 4: 4.7 × 10^2 অনুলিপি/µL; 5: 4.7 অনুলিপি/µl; এবং 6: 4.7 অনুলিপি/µl।
পরীক্ষাগুলি প্রমাণ করেছে যে এমআরএ প্রযুক্তির উচ্চ সুনির্দিষ্টতা রয়েছে, অন্য রোগজীবাণুগুলির প্রতিক্রিয়া না করে সঠিকভাবে ইএইচপি সনাক্ত করা। সংবেদনশীলতার দিক থেকে, উভয় পদ্ধতির সনাক্তকরণের সীমা 4.7 কপি/µl ছিল, traditional তিহ্যবাহী পিসিআর সংবেদনশীলতার তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি।
ক্লিনিকাল নমুনা পরীক্ষা
৩০ টি ক্লিনিকাল নমুনা পরীক্ষা করার ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে মিরা-বয়স এবং মিরা-এলএফডি এর ইতিবাচক হার ছিল 70%, যা কিউপিসিআর এর 80%এর চেয়ে কিছুটা কম তবে traditional তিহ্যবাহী পিসিআর এর 56.7%এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি।
অ্যাপ্লিকেশন সম্ভাবনা
এমআইআরএ-ভিত্তিক সনাক্তকরণ পদ্ধতিগুলি ধ্রুবক তাপমাত্রায় লক্ষ্য জিনগুলির দ্রুত প্রশস্তকরণের অনুমতি দেয়। বিশেষত, এমআইআরএ-এলএফডি পদ্ধতি জটিল পরীক্ষাগার সরঞ্জামগুলির প্রয়োজন ছাড়াই মাত্র 10 মিনিটের মধ্যে ফলাফল সরবরাহ করতে পারে, এটি চিংড়ি খামারে সাইটে ব্যবহারের জন্য আদর্শ করে তোলে। এই প্রযুক্তির উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং সুনির্দিষ্টতা এটিকে EHP এর প্রাথমিক সনাক্তকরণ এবং নিয়ন্ত্রণের জন্য একটি দক্ষ সরঞ্জাম হিসাবে তৈরি করে, যার ফলে ঘাস চিংড়ি কৃষিকাজ শিল্পের স্বাস্থ্য এবং বিকাশ রক্ষা করে।
এই পদ্ধতিগুলির মধ্যে, কলয়েডাল স্বর্ণের পার্শ্বীয় প্রবাহ ইমিউনোসায় (এমআইআরএ-এলএফডি) এর সরলতা এবং স্বজ্ঞাত ফলাফলের কারণে সাইটে অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য বিশেষভাবে উপযুক্ত। ঘাস চিংড়ি কৃষকরা দ্রুত ইএইচপি সংক্রমণের জন্য সনাক্ত করতে এবং প্রতিক্রিয়া জানাতে, রোগ নিয়ন্ত্রণের সক্ষমতা উন্নত করতে, কৃষিকাজের দক্ষতা উল্লেখযোগ্যভাবে বাড়িয়ে তুলতে এবং অর্থনৈতিক ক্ষতি হ্রাস করতে পারে।